2014年12月26日 ツイート

細胞の表面には薬物の受容体などが多数あり、細胞の外側の情報を内側に伝える働きを担っている。生きたままの細胞を使って、これらの分子の動きを解析することが、細胞の活動を理解する上で重要である。QBiCの共同研究チームは新たな量子ドット蛍光プローブを開発し、受容体分子をマルチカラーで標識した。これにより光学顕微鏡の解像度では分離できないほど近傍にある受容体分子を色で区別することができ、より詳細な１分子イメージングが可能になった。

１分子イメージングで生きている細胞の分子の動きを捉える

人間をはじめ、すべての生命の活動は細胞が基本だ。細胞は、生命の活動に必要なエネルギーを作り出し、細胞内外で物質のやり取りを行い、生命を支える諸機能を実現している。このような細胞の活動において重要な役割を担っているのがタンパク質だ。細胞内や細胞膜には、１万種類を超えるタンパク質が存在し、それぞれの役割を担い、協調することで細胞の機能を実現している。また細胞膜表面に存在するGPCRタンパク質は多くの疾病に関与しており、現在用いられている薬の約半数がこれらGPCR膜タンパク質ファミリーをターゲットにしている。

GPCRなどの膜タンパク質に関する研究手法としては、細胞からタンパク質を抽出するなど、生化学や分子生物学的なアプローチがほとんどだったが、最近では蛍光イメージング法により、生きた細胞での膜タンパク質の振る舞いを研究できるようになった。この方法は１分子蛍光イメージングと呼ばれ、全反射照明蛍光顕微鏡などをもちいて膜タンパク質を１分子レベルで観察する。この手法により膜タンパク質が細胞膜上でどのように動いているかを時間を追って観察することができ、膜タンパク質がホルモンや薬物と結合する様子を観測することができる。

しかし、蛍光による１分子イメージングによってもタンパク質の振る舞いを詳細に観察するには限界がある。可視光を用いる場合、光学顕微鏡の分解能の限界は光の波長の半分程度(200 nm)であり、その中にタンパク質がいくつ存在していても1つ1つを区別することはできない。タンパク質の大きさは5 – 20 nm程度なので、分解能の範囲内には数多くのタンパク質が存在する。このため、これまでの１分子イメージングでは膜タンパク質の1割から2割程度しか観察できていなかった。

マルチカラー１分子イメージング法の開発

QBiCナノバイオプローブ研究チームと細胞シグナル動態研究グループの共同研究グループは光学限界内に存在するGPCRタンパク質１つ１つを区別して、その振る舞いをより詳細に観察可能にするため、マルチカラーでの１分子イメージング法を開発した[1]。そのための蛍光プローブとして、半導体の微粒子である量子ドットを用いた。量子ドットは粒子サイズによって発光の色を変えることができ、発光する光の強さも有機色素に比べ10倍以上強く、退色しづらいという特徴を持つ。

高輝度で多色での発光特性を有するサイズの小さい(6 nm以下)量子ドットを合成する方法が確立され、これによりこれまで困難であった細胞膜タンパク質のマルチカラーでの1分子イメージングが簡便にできるようになった。

量子ドットプローブは、GPCR膜タンパクを標識するためのリガンド(ハロタグリガンド: Halo-SH)を量子ドットに結合させることにより作製した（図１）。この量子ドットプローブを用いて細胞性粘菌(Dictyostelium discoideum)のGPCR膜タンパク質の一種cAR1を蛍光標識した。このプローブは粒径が非常に小さいため、標識したGPCRタンパク質の振る舞いを阻害しない。また、有機蛍光プローブ（テトラメチルオーダミン）に比べ、輝度が非常に高く退色しないため長時間での1分子観察が可能だ（図２）。発光波長が緑・赤・近赤外と異なる3種類の量子ドットプローブを用いることによりcAR1タンパク質のマルチカラーでの1分子蛍光イメージングを実現した(図３)。マルチカラーイメージングでは光学限界内に存在する蛋白質を異なる発光色で区別できるため、１色での１分子蛍光イメージングに比べて約3倍もの多くの数のcAR1タンパク質を観測できた 。マルチカラーによる1分子イメージング法により光学限界内に存在するタンパク質を蛍光で区別して検出できることが明らかになった。

これらの利点に加え、汎用性や簡便性も今回開発したプローブの特徴だと筆頭著者のQBiCナノバイオプローブ研究チームの小松崎章仁氏は語る。「ハロタグ融合タンパク質を発現させた細胞を使う研究なら、このプローブがそのまま応用できます。また従来の１分子イメージング用の顕微鏡で計測できるので、多くの研究者に使ってもらえる技術になると期待しています」。

生命現象を支えるタンパク質の働きを顕微鏡で観察しようとするとき、光学限界の問題は避けて通れない。通常の方法では、200nm以内の現象を観察することができないため　２０１４年にノーベル化学賞を受賞した超解像顕微鏡技術など様々なアプローチがなされている。小松崎氏らの研究により、マルチカラー１分子蛍光イメージングが200nm以内にあるタンパク質のダイナミクスを研究するために有効であることが示された。

小松崎氏は「今後はこの技術を用いることによって膜タンパク質のダイナミクスを詳細に明らかにすることができ、GPCRタンパク質が関与した免疫・炎症反応などの作用機構や薬物の作用機序の解明に貢献することができるでしょう。」と語る。

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1. A. Komatsuzaki, T. Ohyanagi, Y. Tsukasaki, Y. Miyanaga, M. Ueda and T Jin, “Compact Halo-Ligand Conjugated Quantum Dots for Multicolored Single-Molecule Imaging of Overcrowding GPCR Proteins on Cell Membranes" Small, 2014. DOI:10.1002/smll.201402508