現在進行中のプロジェクト

心臓・骨格筋のシステム物理生物学

これまでの分子レベルの成果を踏まえて、心臓や骨格筋を対象に、分子から臓器までの階層をシームレスにつないでシステムとして理解・制御する取り組みを行っています。基礎研究としての重要性に加え、肥大型心筋症といった遺伝的心疾患の病態メカニズム解明や精密医療への貢献を目指しています。

分子より上の階層の動態や構造を分子解像度で捉えるために、先端１分子計測技術（１分子蛍光イメージング、レーザー暗視野イメージング、光ピンセット法など）に加え、DNAナノテクノロジー(DNA origami)、超解像イメージング(DNA-PAINT)、高速原子間力顕微鏡観察および、心臓シミュレータとの連動をしながら研究を進めています。

具体的には以下のストラテジーで進めています。

骨格筋や心筋は、進化の過程で最適化された厳密な高次構造(サブセルラーモジュール)であるサルコメアが直列・並列に配置されており、内部には分子モーターであるミオシン分子が密に並んでいます。これまでの研究により、ミオシン1分子の動作は理解されつつありますが、単離された状態での動作であり、サルコメア内での動作が１分子レベルで直視された例はありません。システム内に組み込まれた分子は、周囲の分子との力学的な相互作用やカルシウム応答により協同的に動作し、安定かつ効率的な収縮・拍動、外力場への適応、ロバストネスを獲得すると考えられます。サルコメア内の個々の分子動態をイメージングするために、本研究では、DNA origami技術を応用して、サルコメア内のミオシン分子の空間配置や分子数、分子種が厳密にコントロールされたプラットフォーム（人工ミオシンフィラメント、人工サルコメア）をデザインしています。このアプローチには以下のメリットがあります。

1. 30種類以上のタンパク質からなるサルコメア構成要素の中で、発現や再構成が難しい構造タンパク質(タイチン、ネブリンなど)をDNA origami (DNAナノ構造物)で置き換えるので、容易に再構成が可能
2. DNA origamiのデザイン能力が高いため、進化の過程で得られた筋肉の空間配置の役割の検証、心筋症の原因となる変異型ミオシン、心筋α,βミオシンを混在させるなど生体内で想定されるヘテロなミオシン集団の定量解析および、サルコメア内の任意の位置に蛍光・光散乱プローブを複数種ラベルできるので、分子間の協調性を定量的に解析可能、高速AFMでの解析がしやすいように分子システムを構成可能
3. 複雑なサルコメアを粗視化しモデル解析と密に連動させることで、筋収縮の本質的なアーキテクチャを理解、ステップバイステップでサルコメアタンパク質を追加や複雑性を上げられるので、サルコメア内における各因子の機能が明確に解析可能

サルコメアは、分子と細胞をつなぐ階層に位置し、このプラットフォームを用いて得られるデータを心臓シミュレータにデータ同化させることで、シミュレータの予測能力の向上および、分子・サルコメア動態と臓器動態との連関が議論できるようになります。

このように、"単分子分解能での動態計測", "分子・細胞システムのデザイン", "階層をつないだシミュレーション"を連動させることによって、分子レベルから臓器レベルまでの動態をシームレスにつないだ理解を目指しています。そのために、現在はin vitro実験が主ですが、骨格筋細胞や心筋細胞を使ったin vivo実験の立ち上げや共同研究、心臓にＸ線をあててサルコメア動態を高解像度で計測する in situ実験との共同研究なども進めようとしています。

1. ミオシンフィラメント内のミオシン分子動態を精密に分析するための分子プラットフォーム

DNAorigamiを用いることで、天然のミオシンフィラメント構造を模倣した足場構造を作製しました。進化の過程で自然に設計されたサルコメア構造はミオシン分子間の協同運動などに影響を与え、筋収縮に最適な集団運動を生み出すと考えられています。従来の方法で再構成されたミオシンフィラメントは、天然のミオシンフィラメント構造を厳密には再現せず、さらには、高密度にミオシン分子が集積しているため、個々のミオシン分子動態を1分子解析することが難しかったのですが、DNAorigamiを足場にしたミオシンフィラメントによって解決することができました。レーザー暗視野イメージング、高速原子間力顕微鏡観察を行い、フィラメント内のヒトミオシンの動作が初めて直接的に可視化されました。今後は、肥大型心筋症を引き起こすミオシン変異体の動作や、ミオシンをターゲットにした心筋症の薬の候補となる低分子化合物の作用を精密に分析するプラットフォームとしての利用を行います。得られた結果を心臓シミュレータにデータ同化させることで心臓の各階層での影響を調べ、精密医療に繋げます。

参考文献

• “Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments"
  K. Fujita, M. Ohmachi, K. Ikezaki, T. Yanagida, M. Iwaki†
  Communications Biology, in press (2019) (†corresponding)

DNAメカノテクノロジー・超解像イメージング

本研究室では、DNA origamiと呼ばれる技術を最大限に活用します。DNA origamiは、遺伝子の実体であるDNAをナノ材料として用い、様々なナノ構造物を作成する技術で、生物学、物理学、材料科学やコンピュータ科学などの広範な分野に応用されるようになりつつあります。デザインの複雑性と大規模化の能力は年々進歩しており、DNAの塩基配列情報をベースにした、分子の空間制御、自己集合制御能を活用して、センサー、演算、アクチュエータ機能等を持ったナノスケールデバイスを実現できるようになり、NatureやScienceの表紙を飾ることも増えてきました。

本研究室では心臓研究への応用を進めていますが、以下のプロジェクトも推進しています。

1. 世界最小のコイル状人工バネ(ナノスプリング)を用いた分子・細胞・組織のフォースセンシング

DNAのみを材料にして、コイル状の人工バネを作成しました。タンパク質と同程度のサイズであり、利点としては、

1. バネの硬さがプログラム可能
2. 化学修飾が容易で多様な生体分子に連結可能
3. 線形バネに近い弾性を持つため定量性が高い（高分子ポリマーや弾性タンパク質は物性が複雑）
4. 生体適合性が高い

が挙げられます。

in vitro実験における実用化を終えており、モーター分子が生み出す力学的相互作用や力学特性の評価とFIONA, SHRECといったナノメートル精度の1分子蛍光イメージングを同時にできるようになりました。現在では、心筋細胞を含む様々な細胞種の細胞内・細胞間および組織内にナノスプリングを連結し、細胞が生み出す機械的な力（＝力学的シグナル）のイメージング・操作するための開発に取り組んでいます。将来的には、光応答性の分子と組み合わせることで光学的にナノスプリングを伸縮させることができるため、光制御のメカノバイオロジーが実現できると期待しています。メカノバイオロジーが対象とする様々な細胞、組織の研究、発生やオルガノイド研究などへの応用を目指しています。

参考文献

• “A programmable DNA origami nanospring that reveals force-induced adjacent binding of myosin VI heads"
  M. Iwaki†, S.F. Wickham, K. Ikezaki, T. Yanagida, W.M. Shih
  Nature Communications, 7, 13715 (2016) (†corresponding)

2. 究極解像度の超解像イメージング技術(DNA-PAINT)を用いた細胞内分子観察

DNA-PAINT (DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography)は、超解像イメージングの一種である蛍光分子局在化法(PALM, STORMなど)であり、PALM, STORMの空間分解能である20-30 nmをはるかにしのぐ、2-3 nmの解像度を実現します (参考文献：Dai et al., Nature Nanotech., 2016)。空間分解能を向上させるポイントは、蛍光ラベルした一本鎖DNAとその相補鎖のハイブリダイゼーションを利用した蛍光分子の明滅キネティクス制御と、顕微鏡のドリフト補正を極限まで行うためのドリフトマーカーをDNA origamiにて作成するところになります。現在、細胞膜上のEGFレセプターの会合状態や筋細胞内のサルコメア、細胞骨格構造観察などに応用を進めています。

ナノバイオロボティクス

本研究室では、生命現象を1分子解像度で観察することにこだわりを持って装置開発などを行っています。これまでのタンパク質1分子レベルでの研究によって、タンパク質構造の不均一性や多形性、記憶現象が観察されています。このことは、同一のタンパク質分子種でも分子ごとに個性を持つことを意味しており、このような個性（＝自律性と可塑性）を持った要素が自己組織化されて細胞などが構築され、生命機能が創発します。そのため、無個性で均質な要素のみから構成されることの多い人工機械システムとは対照的です。無個性で均質な要素からなる集団であれば、個々の要素を見ずに集団平均でも理解ができそうですが、不均質で時々刻々と状態が変化する個性を持った分子システムでは、個々の状態の時間的な変化や状態の分布を知る、そして集団平均に隠れたレアイベント、レア状態を捉えることが重要だと考えています。レアなイベントやレア状態がシステム全体を大きく変えることがあるからです。このようにバラエティを持つ要素はある意味不安定であり、工学的な視点からは信頼できないネガティブな印象もありますが、外乱に対する適応性や柔軟性を獲得し、環境変動にも耐えうる安定なシステムを実現するための性質としてポジティブに利用しているようにも見えます。本研究室では、アクチュエータとして働く分子モーターや遺伝子転写・合成に関わるような分子モーター群から構成されるシステムをDNA origamiと組み合わせてシステムを構成し、1分子解像度で解析することで生体分子システムの機能創発を理解しようとしており、そのような再構成のアプローチをナノバイオロボティクスと名付けました。Richard Feynmanの”What I cannot create, I do not understand”というメッセージどおり、作って理解するというスタンスです。